比起失去亨利八世的爱意，安妮·博林更在意亨利八世是否会重新成为天主教徒，为了防止宗教改革夭折，安妮·博林选择让同为新教信徒的堂妹玛格丽特·谢尔顿（ Margaret Shelton）成为亨利八世的情人。
1535年，简·罗奇福德和安妮·博林的姑妈威廉·霍华德（William Howard）发表公开声明，表明支持正统天主教君主制代表人物玛丽一世的立场，简更是冲进了格林威治的中心，这份声明成为了玛丽游行示威的一部分，引发了骚乱，简和霍华德被关入伦敦塔，此事不可避免的影响到了作为英格兰王后的安妮·博林以及她在之后宗教改革中的话语权。
1535年秋天，安妮·博林再次怀孕，这一喜讯在圣诞节的时候被公开，同时亨利八世将安妮·博林的表妹简·西摩（Jane Seymour）作为新的情人人选，但简·西摩是虔诚的天主教教徒让安妮·博林不免担忧。
1536年1月，前任王后凯瑟琳在金博尔顿去世，同天，安妮·博林再次流产，期间有天主教徒散布谣言说这是乱伦的产物，安妮·博林与亨利八世的感情宣告破裂。
1536年1月，前任王后凯瑟琳去世后，亨利八世与查理五世之间有了缓和矛盾的机会，克伦威尔认为安妮·博林的存在使得当初英格兰王室与教皇克雷芒七世决裂，并且安妮·博林致力于宗教改革的行为激怒了天主教徒，为避免内部分裂，必须牺牲安妮·博林。
1536年4月24日，亨利八世在克伦威尔递上的委任状上署名，授权大法官查尔斯·布兰登以及数名贵族对犯下叛国罪的人进行全名盘查。
6天后，克伦威尔接到汇报称安妮·博林与马克·斯米顿存在不正当关系，随后马克·斯米顿被逮捕，在审讯过程中他承认与安妮·博林有私情，并供出其他与安妮·博林有私情的人，分别是弗朗西斯·韦斯顿、亨利·诺雷斯和威廉·布里尔顿，之后安妮·博林的弟弟乔治·博林也被加入通奸名单，随后安妮·博林被指控通奸叛国，但她此时的身体状况很差，指控内容并非事实。
在严刑拷打下，最后所有人都承认，安妮王后有不忠的行为。1536年5月2日，安妮由驳船带到伦敦塔，轻度精神崩溃。5月14日，克兰默宣布安妮与亨利的婚姻无效。5月15日，在伦敦塔里，安妮被指控通奸、乱伦和叛国罪，即使安妮敏锐的头脑和伶牙俐齿帮助她多次有力地反驳了对自己的指控，却改变不了最后的判决。5月17日，乔治·博林等被控告的几名男子被处决。
5月19日，上午9点刚过，历史上最富盛名的女人之一，迎来了她悲惨的结局。安妮是因为通奸、乱伦、叛国、制造假币、精神疾病、企图毒死凯瑟琳王后和玛丽公主等18项罪名，被判决斩首。亨利八世从法国请来一位有名的刽子手，让他用一柄极其锋利的长剑，以一种相对优雅的手段，砍下了安妮的脑袋，被斩下的首级甚至还公开展示了一段时间。之后安妮被草草埋葬，才两岁八个月的伊丽莎白成为私生女，被赶出王宫。
国会没有通过让安妮以合适的棺材埋葬，安妮的头与身体被放入一个柜子，埋在伦敦塔的教堂中。安妮的冤情即使在她的女儿伊丽莎白时代也从未被平反，甚至连一块墓碑也没有，直到在维多利亚女王时代翻修时，才被发现确认，覆上一个大理石墓碑。
安妮被处死后第二天，亨利八世随即与安妮生前的侍从女官珍·西摩订婚。十天后正式举行婚礼，珍·西摩成为新王后（珍又称简，来自西摩家族，天主教信仰）。
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