机会很快就来了，因为查理五世解除了和玛丽公主的婚约，转而迎娶了葡萄牙的伊莎贝拉的行为，让亨利八世和大为恼火。
亨利八世开始怨怪凯瑟琳王后和她的娘家，认为是因为凯瑟琳才会让他颜面尽失。
加上凯瑟琳王后迟迟没有生出男性继承人，安妮的野心开始膨胀。
安妮得到了新教派的支持，因为天主教会的腐败，在英格兰国内已经民怨四起，而安妮则承诺，如果支持她成为新王后，那么她将会让新教取代天主教成为英格兰国教。
安妮开始怂恿亨利八世离婚。
由于对安妮的迷恋和对男性继承人的渴望，亨利八世于1527年与大臣向梵蒂冈递交了他与凯瑟琳王后的婚姻无效申请。
亨利八世此举惊叹欧洲，人们不愿意相信亨利八世会放弃凯瑟琳王后身后强大的娘家支持，但亨利八世却安妮的迷恋和对男性继承人的渴望，让他坚持那么做。他相信年轻貌美的安妮一定能替他生个儿子。
1527年5月18日，主教托马斯·沃尔西在威斯敏斯特召开教廷会议审议亨利八世婚姻的合法性，此时罗马教廷的教皇克莱门特七世被神圣罗马帝国皇帝查理五世控制，查理五世反对离婚，5月31日，沃尔西被迫休庭。
在离婚案件审理期间，安妮·博林与沃尔西有所往来，他们共同促进亨利八世与凯瑟琳的离婚事宜，但沃尔西的目的是让亨利八世与法兰西的勒妮结合，教皇被查理五世监禁后，沃尔西奉命前往法国解救，并且在那里召集一次枢机主教大会从而推进离婚程序。
1528年，红衣主教坎佩乔抵达英国参加亨利八世的离婚案件审核，但听证会直到次年1月仍未举行，安妮·博林怀疑沃尔西背叛，所以教会故意拖延离婚程序。之后安妮·博林送给侍女·盖恩斯福特的禁书《基督教徒的顺从及基督教执政者如何治理国家》被发现，安妮·博林在沃尔西告密前向亨利八世献上了此书，亨利八世满意于书中所述君王权利大于教会的表述。
1529年5月，亨利八世与凯瑟琳的离婚审判于黑衣修道院开始，安妮·博林被送回赫弗城堡，这次的离婚审判沃尔西依旧没能帮助亨利八世胜诉，11月，沃尔西被剥夺公民身份和财产权，并于次年死去。沃尔西死后，克伦威尔被招进王宫并于次年升任枢密会重要成员，安妮·博林则搬进了沃尔西在约克广场的旧居，神学家们被纷纷说服同意离婚案。
1530年，查尔斯·布兰登（Charles Brandon）国王的妹夫叛逃并宣扬安妮·博林与托马斯·怀亚特之间有私情，他的话语此时并未对安妮·博林产生影响，安妮·博林在随后也驳回了他的指控。
1532年9月，亨利八世封安妮·博林为彭布罗克女侯爵，两个月后，他们在加来秘密举行了婚礼，次年1月25日在伦敦再次举行婚礼。5月23日，新任坎特伯雷大主教托马斯·克兰默（Thomas Clamor）宣布亨利八世与凯瑟琳的婚姻无效，并在5天后宣布亨利八世与安妮·博林的婚姻有效，6月1日，安妮·博林正式加冕为王后并于9月7日诞下女儿伊丽莎白一世，伊丽莎白一世出生不久后就被送往赫特福德郡，之后安妮·博林常去探望她。
除此之外，安妮·博林曾在1534年请求玛丽一世看望伊丽莎白一世，并承认她的王后身份，并说这是玛丽与亨利八世缓和关系的手段，而玛丽将会得到比之前更好的待遇。
安妮·博林的王后排场比前任王后凯瑟琳还大。她有超过250个仆人专职伺候，60个贵族侍女陪伴她。安妮添购许多奢华的礼服、珠宝首饰、羽毛扇、马车、家具等，也重新装潢了几个宫殿以符合她的品味。
安妮·博林聪明果决，自信强势，对政治敏锐热衷，颇有手腕，堪称是亨利八世最完美的情人；然而当安妮成为亨利的妻子后，却变得多疑残忍，刁钻刻薄。后来亨利也对频频干政并且试图推动宗教改革朝更加激进的方向发展的安妮感到厌倦，认为她言辞尖锐、个性泼辣、野心勃勃，并不适合担任一国之母。
1534年4月，安妮·博林再次怀孕，但在三个月后不幸流产，这次流产被亨利八世认为是不洁的分娩行为，因此她被关了起来，早在安妮·博林第一次怀孕的最后几个月，亨利八世就有了其他情人，流产后安妮·博林与亨利八世的感情开始破裂。
一个月后，安妮·博林收到了法国考虑与前任王后凯瑟琳的女儿玛丽一世联姻的消息，这表示法国不承认伊丽莎白一世继承人的身份，安妮·博林因此不满。为了使伊丽莎白一世获得合理继承权，亨利八世于1534年颁布了《继承权法案》，剥夺了玛丽一世的王位继承权，改为安妮·博林所生子女拥有合法继承权。
尽管安妮·博林的身体已经有所好转，但她依旧无法独自处理亨利八世的情人，于是安妮·博林寻求哥哥的妻子简·罗奇福德（Jane Rochford）的帮助，但不久后简就被亨利八世送出宫廷，并宣称简参与了一项阴谋，这使得安妮·博林的声望受到影响。
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